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    全球首篇|Visium空間轉錄組技術如何應用于人類背外側前額葉皮層研究

    來源: 安諾基因   2020-4-16   訪問量:608評論(0)

    近兩年,空間轉錄組技術大火,對新技術感興趣的小伙伴可能都已經看過幾篇空間轉錄組的文章了,但大家是否發現之前空間轉錄組文章中實驗所用的芯片規格和現在10x Genomics公司推出的Visium空間基因表達芯片規格是不同的呢?因為這些文章都是利用原Spatial Transcriptomics公司的技術,它在2018年底已被10x Genomics公司所收購。10x Genomics Visium空間基因表達解決方案是第一代“Spatial Transcriptomics”方法的升級版,空間分辨率是原來的5倍,具有更高的性價比。3月份,全球第一篇Visium預發表文章作者在10x官方研討會分享了空間轉錄組技術如何助力人類背外側前額葉皮層研究(詳情點擊下方閱讀原文),下面,就和勤勉的小編一起學習這篇文章吧~

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    研究背景

     

    大腦的功能與空間結構密切相關,這種結構-功能關系在人大腦皮層的層狀組織中尤為明顯,其中位于不同皮層的細胞表現出不同的基因表達模式,以及不同的形態、生理和連接模式。由于與神經精神疾病相關的基因表達于特定的大腦皮層,因此,在細胞分辨率下定位人大腦中空間基因的表達對于進一步了解疾病致病機制至關重要。

    本研究選擇人背外側前額葉皮層(DLPFC,一種與許多神經精神疾病有關的大腦區域)進行10x Genomics Visium空間轉錄組測序,繪制DLPFC基因表達的層狀圖譜,并利用已發表的大規模snRNA-seq研究的數據進行驗證,同時提高細胞亞群注釋的準確性。為了進一步臨床轉化應用,將本研究數據集與已發表的各種神經精神疾病基因集進行了整合,以證實自閉癥譜系障礙(ASD)風險基因的優先layer-enriched表達和幾種神經精神病的風險layer-enriched關聯,說明了本實驗數據可應用于臨床轉化。


    實驗材料


    人死后的背外側前額葉皮質(DLPFC)組織切片,12張,組織切片厚度為10 μm。


    文章思路


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    圖1 文章研究概覽

     

    主要研究結果

    1. Visium空間轉錄組數據統計

    選取3個正常成人,分別獲取0 μm處和300 μm處的2對連續的組織切片,每對連續的組織切片可作為空間重復,共12個樣本,平均每張切片測序量為291.1M reads,每個spot平均檢測到1,734個基因和3,462個唯一的UMI。平均每個spot包含3.3個細胞。在垂直于腦膜表面的平面中獲取組織切片,該平面延伸至灰質和白質交界處。通過勾畫第6層(L6)和相鄰的白質(WM)之間的邊界和通過每個組織切片的灰質/神經元,WM /少突膠質細胞和L5的標記基因(SNAP25、MOBP和PCP4)識別L5來確認每個樣品的方向。

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    圖2 空間轉錄組實驗設計


    2. DLPFC的基因表達

    通過對每個空間重復中每一層每個基因的總UMI數生成layer-enriched表達譜來進行 pseudo-bulked處理,將12個樣本中的47,681個點匯總到76個分層聚合的基因圖譜中, 消除了稀疏性并大幅增加了基因的UMI覆蓋率。layer-enriched表達譜的無監督聚類揭示了與皮層差異(尤其是白質和灰質之間)相關的數據變化的主要成分,其在每對空間重復樣本中一致性較高。利用3種Layer-level基因建模策略(ANOVA、Enrichment和Pairwise)進行差異基因分析,均顯示人的成年DLPFC不同層之間廣泛的基因表達差異。

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    圖3 DLPFC中Layer-enriched 基因表達


    3. 鑒定人類皮層中新的layer-enriched基因

    本研究系統的評估了已發表的人和嚙齒動物大腦皮層相關數據集中的marker基因在成人DLPFC 的layer-enriched基因表達數據集中的魯棒性,進一步證實了與分層富集相關的典型marker基因,同時利用艾倫大腦研究所的人類大腦圖譜中公開發表的smFISH數據進行驗證。本研究中還找到了新的layer-enriched差異表達基因,并利用RNA scope進行驗證。

     

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    圖4 已發表的smFISH數據驗證Visium數據集有效性

     


    4. 單細胞核轉錄組測序(snRNA-seq)的空間注冊

    將人腦組織生成的snRNA-seq數據集增加空間分辨率,有可能為分子定義的細胞類型的功能提供更深入的了解。從Visium數據中enrichment model下獲得的layer-enriched表達譜和差異表達統計相關數據被用于snRNA-seq數據集進行空間“注冊”,可向不包含固有解剖信息的數據驅動的表達cluster中添加layer-enriched信息。首先使用來自已發表的snRNA-seq數據和bulk RNA-seq數據來驗證這種策略。然后使用layer-enriched的統計數據對來自人類皮層的三個獨立snRNA-seq數據集進行空間“注冊”,分別為本實驗的2個DLPFC樣本的snRNA-seq數據、已發表的48個阿爾茨海默病樣本的snRNA-seq數據和41個樣本的自閉癥譜系障礙的snRNA-seq數據,空間配準策略可應用于任何現有的來自分離細胞的snRNA-seq或scRNA-seq數據集,以補充解剖學信息。

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    圖5 snRNA-seq數據空間注冊


    5. layer-enriched基因表達譜的臨床意義

    分別選取與不同紊亂疾病相關的基因集、各種腦疾病患者和正常人的死后大腦中差異表達的基因集和全轉錄組關聯研究(TWAS的遺傳風險相關的基因集來評估空間基因表達的臨床相關性,證明了ASD和SCZD中涉及的基因的優先layer-enriched表達,分析結果顯示可通過將成年DLPFC的layer-enriched基因表達納入風險基因的解釋,以便收集臨床見解。例如,ASD和SCZD中涉及的基因的優先layer-enriched表達,主要與神經發育遲緩(NDD相關的基因在L2中優先表達,而主要與ASD相關的基因在L5中優先表達。

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    圖6 Layer-enrichment神經發育和神經精神的基因集

    6. DLPFC中的數據驅動的layer-enriched分群


    相對于基于細胞結構的人工注釋laminar cluster,本研究評估了基于空間可變基因的數據驅動的注釋方法。無監督的方法可以用來識別新的空間組織,特別是與抑制神經元亞群、腦血管或免疫功能相關的空間組織,同時還確定了NPY、HBB和IGKC的可變空間表達。layer-enriched基因可以用來幫助數據驅動的人類皮層聚類,并且比以前定義的標記表現得更好。數據驅動的方法可以識別之前未知的細胞組織,也可以應用于其他形態模式不像大腦皮層那樣明確的人類組織或大腦結構。

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    圖7 DLPFC中的數據驅動的layer-enriched分群


    小結

    本研究繪制了人DLPFC的基因表達空間層狀圖譜,發現成年人DLPFC不同層之間廣泛的基因表達差異。利用已發表的大規模snRNA-seq研究的數據進行驗證,找到新的 layer-enriched 差異表達基因,以便提高細胞亞群注釋的準確性,同時空間“注冊”策略可對常規的snRNA-seq或scRNA-seq數據集進行解剖學信息的補充。通過將成年DLPFC的layer-enriched基因表達納入風險基因的解釋,以便收集臨床見解。數據驅動的方法可以識別之前未知的細胞組織,也可以應用于其他形態模式不像大腦皮層那樣明確的人類組織或大腦結構。鑒于空間轉錄組學有望將分子細胞類型與形態學、生理學和連接性相關的功能學聯系起來,這將成為神經科學和精神病學中轉錄組學的下一個前沿。

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    安諾單細胞測序技術總覽


    作為國內單細胞測序技術整體解決方案的提供商,目前安諾基因單細胞多組學研究具有全面的產品,覆蓋三大組學(基因組、轉錄組、表觀組),擁有豐富的項目經驗、合作單位100+、物種經驗50+、多篇高分文章IF累計200+,能夠有針對性并準確服務于不同的研究領域及研究策略,使得科研工作者可以更深入地了解細胞間的異質性。


     

    參考文獻:

    Kristen R. Maynard, Leonardo Collado-Torres, Lukas M. Weber,et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex[J]. bioRxiv, 2020.

     

     



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